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			大肠杆菌O157：H7 黄曲霉毒素 李斯特菌 沙门氏菌 盐酸克伦特罗（clenbuterol） 氯霉素残留及检测 磺胺类药物
			沙门氏菌 一、概述 1885年沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，故定名为沙门氏菌属。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位 。 二、 流行病学 (一) 流行概况 世界上最大的一起沙门氏菌食物中毒是1953年于瑞典,由吃猪肉而引起的鼠伤寒沙门氏菌中毒，7717人中毒，90人死亡。由于沙门氏菌型、菌株不同，使人发病的菌量也不同，一般使人发病的菌量平均为107以上。鼠伤寒沙门氏菌是最常见的血清型，在国外占27.7-80%，其次为肠炎沙门氏菌占有10.3%。 (二) 分布 沙门氏菌分布很广，广泛在于自然界中，常可在各种动物，如猪、牛、羊、马、等家畜及鸡、鸭、鹅、等家禽，飞鸟、鼠类等野生动物的肠道中发现。鸡是沙门氏菌最大的储存储主，鸡群暴发死亡率高达80%，也存在于蛋类、蛋粉及其它食物中(牛肉、猪肉、鱼肉、香肠、火腿等)。 (三) 传播途径 大多通过吃进被沙门氏菌污染的食品，吃感染了沙门氏菌的动物内脏及蛋，人传给人。 1、肉的污染：肉及其制品的沙门氏菌检出率美国为20-25%、英国为9.9%、日本检查进口家禽的污染率为10.3%、 国内肉类沙门氏菌检出率在1.1-39.5%。牛、马、猪感染多呈全身丁当，形成败血症。因此吃死牲畜多引起食物中毒型沙门氏菌感染。 2、蛋的污染：我国蛋及其制品沙门氏菌检出率为3.9-43.7%，由于吃蛋引起鼠伤寒病的病例报告逐渐有增加的趋势。 3、环境污染：食品在加工、运输、出售过程中往往被沙门氏菌污染。沙门氏菌在粪便、土壤、食品、水中可生存5个月至二年之久。 4、传播问题：恢复期病人和无症状的带菌者也是常见的传染源。 三、生物学特性： 1、型态与染色：本属菌为1-3um长，0.5-1um宽，需氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌，除鸡沙门氏菌外都有周身鞭毛，能运动，多数有菌毛。 2、培养物特性：营养要求不高，在普通培养基上即可生长，在液体培养基中呈均匀混浊生长。在SS琼脂和麦康凯琼脂培养基上37℃24小时可形成直径约为2-4mm的半透明菌落，对胆盐耐受。 3、抗原结构：沙门氏菌具有复杂的抗原结构，主要有三种抗原，即菌体抗原、鞭毛抗原和表面抗原。沙门氏菌的分类原则是以菌体抗原为基础分成群，每群中再以鞭毛抗原来分型。 菌体抗原：即为O抗原，是细菌细胞壁上的脂多糖，能耐热100℃达数小时不破坏。 鞭毛抗原：即H抗原，是蛋白，不稳定，加热或酒精处理都能被破坏。 表面抗原：表面抗原有两种即Vi及M抗原。 4、致病性：伤寒沙门氏菌，甲、乙、丙型副伤寒沙门氏菌和仙台沙门氏菌等只对人类致病，而马流产沙门氏菌，雏沙门氏菌只 对马和鸡致病。可引起如下类型的疾病。 (1) 肠热症：即伤寒(伤寒沙门氏菌引起)和副伤寒(甲、乙副伤寒沙门氏菌引起)。本病的潜伏期为7-20天，伤寒的病程可达一个月，副伤寒病程稍短，目前所见肠热症的临床表现常以轻型和不典型为主。伤寒与副伤寒的鉴别诊断有赖于细菌检验。病后约有2/3的伤寒病人，可发展成慢性带菌者。 (2)食物中毒：一般引起胃肠炎，即上吐下泻。引起食物中毒的沙门氏菌以鼠伤寒、肠炎、汤卜逊、猪霍乱及乙型、丙型副伤寒沙门氏菌等常见。由于食入含有大量细菌的食物而引起，潜伏期为8-48小时，有恶心、呕吐、腹泻、腹痛、发烧等症状，病程 2-5天，重者可持续几个星期。 (3)慢性肠炎：临床上表现为发烧，粘液便，类似痢疾。此病多见于幼儿和老年人。 (4)败血症：多由猪霍乱沙门氏菌引起，病人有高烧、寒战、厌食和贫血等症状，常伴有局部病灶(如胆囊炎等)，一般可从血液中分离出病原菌。 四、 检验技术： （一）国标法 ( 常规法 ) 1、前增菌和增菌。冻肉、蛋品、乳品、及其它加工食品均应经过前增菌，各称取检样25g,加在装有225ml缓冲蛋白胨水的500ml广口瓶内。固体食品可先应用均质器，以8000-10000r/min打碎1min或用乳钵加灭菌砂磨碎：粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，于36℃加热培养4小时(干蛋品需培养18-24小时)，移取10ml转移种于1ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸纳煌绿增菌液内，于36±1℃培养18-24小时(前增菌的目的是使食物样品在含有营养的非选择培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态)。 鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其它未加工的食品不必经过前增菌。各取25g(25ml)，加入灭菌生理盐水25ml，做成检样匀液，取其半量接种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸纳煌绿增菌液内，于42℃培养24小时；另半量接种于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36±1℃培养18-24小时。 2、分离：取增菌液1环，划线接种于亚硫酸铋琼脂培养板和DHL琼脂平板(或WS、HE、SS琼脂平板)各一个。于36±1℃分别培养18-24小时(DLH、HE、WS、SS)或40-48小时(BS)。观察各个平板上生长的菌落。(采用选择性培养基进行分离的目的是在含选择性抑制剂的促生长培养基中抑制非沙门氏菌生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别)。 3、生化学鉴定：在接种三糖铁琼脂的同时，再接种蛋白胨水(供靛基质试验用)尿素琼脂pH7.2的，氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养各一管，于36±1℃分别培养18-24小时，必要时延长至48小时，判定结果，如遇到非典型菌株，可根据情况补做有关生物化学试验，必要时进行各亚群的鉴定。 4、血清学分型： (二)金标试纸法 将样品经过特殊的前增菌及增菌后，取120ul的增菌培养液放入试纸夹的样品槽中，样品由于毛细管作用移至反应区，反应区中含有特殊的抗体(沙门氏菌抗体)它与胶体金颗粒共轭偶联。如果样品中存在抗原，将同金标抗体结合形成抗原-抗体复合物，沿着硝酸纤维素膜向前移动至含有固定的抗沙门氏菌抗体区域(T区)，金标免疫的复合物与该区域的抗抗体发生特异性结合形成一条可见的线。其它的样品继续移动到膜的未端，最终进入废物池被遗弃。 反应区也含有金标结合的一种专利抗原(颜色指示剂)，不管样品中有没有沙门氏菌抗原，它都被样品洗脱。金标控制指示剂通过膜移动到阴性控制区与专利抗体结合形成一条可见的线。无论样品中有没有沙门氏菌抗原，控制线都将在控制区(C区)形成，来确保试验正常进行。 增菌液滴入8-10分钟后，观察试纸C区和T区有无明显的线。在C和T区都有可见的线，则结果为阳性。C区有线、T区无线，则结果为阴性。如C区无线，无论T区有没有线，则实验无效。如有沙门氏菌存在，试纸T区有一个明显的线，线的强度与沙门氏菌的比例成正比，如果T区有一条明显可见的线，无论它的强弱，样品都应被 认为是阳性的。 (三)ISO－GRID检测系统 ISO－GRID检测系统是一种基于疏水性网膜（HGMF）的过滤系统。该系统通过使用这种含有1600个小方格的滤膜，来对微生物进行检测或计数。 首先，稀释的样品通过5 um的不锈钢预过滤器过滤，过滤掉可能引起微生物分析误差的样品残渣颗粒。 然后，样品通过流水的滤膜过滤。再将滤膜放在特异性的琼脂培养板上培养，以检测目标微生物。培养完成后，在膜上检测目标微生物，并记录阳性区域的数量。 滤膜不会染上琼脂培养基的颜色，从而很容易地区别微生物，并进行鉴别和记数。此方法快速简便，重复性好，而且，除沙门氏菌外，还适用于大肠杆菌O157﹕H7、酵母、霉菌、大肠菌群及大肠杆菌的检测和计数。 (四)单克隆酶联免疫分析筛选方法 该方法是对所有食品沙门氏菌的存在进行筛选，不是确证试验，因为试验中所用的单克隆抗体可能与少部分的非沙门氏菌有交叉反应。 阳性的检疫结果应是客观的，必须配有450nm滤光片的光度计来进行测试。只有当阴性和阳性对照均有可接受的光密度读数时，阳性结果才是有效的。 原理 沙门氏抗原的检测是基于用特异性单克隆抗体进行的酶免疫分析(EIA)。用抗沙门氏菌抗原的单克隆抗体包被于聚苯乙烯微量小孔的内表面，将样品和对照加入小孔中。样品中如有沙门氏菌抗原存在，则将被吸附在孔上的特异性抗体吸收。冲洗后，加入结合剂与被抗体吸收的沙门氏菌抗原结合。再冲洗小孔，除去未结合的结合剂，然后再加入酶底物。当用终止液终止反应时，出现的蓝色则转变为黄色。样品中是否有沙门氏菌抗原取决于颜色产生的光密度。 (五) 自动酶联荧光免疫检测系统（VIDAS）筛选法 此沙门氏菌的抗原鉴别是基于在VIDAS仪器内进行的酶联荧光免疫分析。像吸液管的装置是固相容器（SPR），在分析中既作为固相也作为吸液器。SPR包被有高特异的单克隆抗体混合物。将一定量的增菌肉汤加入试剂条，肉汤中的混合物在特定时间内循环于SPR内外。如果有沙门氏菌抗原存在则与包被在SPR内的单克隆抗体结合，其他没有结合上的化合物被冲洗掉。结合有碱性磷酸酶的抗体在SPR内外循环与结合在SPR内壁上的沙门氏菌抗原结合，最后的冲洗步骤将没有结合的接合剂冲洗掉。底物—4-甲基伞形磷酸酮被SPR壁上的酶转换成荧光产物—4-甲基伞形酮。荧光强度由光学扫描器测定。实验结果由计算机自动分析，产生基于荧光测试的试验值与标准相比较后打印出每一个被测样品的阳性或阴性结果报告。 (六)沙门氏菌快速酶触反应显色培养基法 快速酶触反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将它们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。这种技术将传统的细菌分离与生化反应有机的结合起来，并使得检测结果直观，成为今后微生物检测发展的一个重要发展方向。据Manafi等报道，沙门氏菌属（包括各亚属）均产生辛酯酶，这一性能是肠杆菌科除沙雷氏菌属外其它各属细菌所不具备的，因此可用来鉴别沙门氏菌与肠杆菌科其它属细菌利用细菌的特有生理生化反应，使培养基中的指示剂产生颜色变化，以将目标菌与其他菌区别开。 (七)DNA探针技术 DNA探针技术是最新发展起来的一项特异、灵敏、快速的检测方法，但因有一定比例的假阳性反应，故所有阳性结果必须用标准的培养方法加以确证， 原理　用特异性的DNA探针进行沙门氏菌核糖体RNA（rRNA）的检测。待检样品经前增菌、选择性增菌和后增菌后，溶解细菌。加入标记好的沙门菌特异性的DNA探针用于液相杂交。如果待检样品中存有沙门氏菌rRNA，荧光素标记的检测探针和多聚脱氧腺嘌呤核苷酸(polydeoxyadenylic acid,poly dA)末端捕获探针将与目标rRNA序列进行杂交。然后把包被有多聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸(polydeoxyadenylic acid,poly dT)(固相)的测杆插入杂交溶液。Poly dA和pol dT之间进行碱基配对，便于探针捕获：目标杂种核酸分子结合在固体载体上，未接合的探针被冲洗掉。测杆被培养在辣根过氧化物酶-抗荧光素接合剂中。接合剂与存在于杂交检测探针上的荧光素标记物结合，未结合的剂被冲掉。并将测杆培养于酶底物-色原溶液中，辣根过氧化物酶与酶底物反应，将色原转变为蓝色化合物。一旦遇酸反应便停止，色原的颜色变为黄色。在450nm处测量吸收值，吸收值大于临界则表明在待检的样品中存有沙门氏菌。 (八)聚合酶链反应(PCR)技术 PCR技术原理为提高DNA探针的敏感性，可先将靶 DNA序列扩增，增加 DNA数量，使其达到足够的检测量，若反应以动力学为基础，则能定量分析。1983年 Millus和 Cetus发明了最基本的扩增 DNA或增加样品中特殊核苷酸片段数量的方法-聚合酶链反应即PCR法。PCR法建立在三步重复发生反应的基础上。①通过热处理将双股DNA变性裂解成单股DNA；②退火延伸引物至特异性寡核苷酸上；③酶促延伸引物与DNA配对合成模板，引物退火，变性DNA片段，引物杂交形成的模板可参与再次反应。溶液中核苷酸通过酶聚合成相互补对的DNA片段，并能重新裂解成单股DNA成为下次PCR复制的模板。因此每次循环特异性DNA将以双倍量增加。典型扩增经过20～40次循环能引起100万倍的扩增。在PCR反应中引人Taq聚合酶使反应得以半自动化和简便反应程序。用扩增DNA进行的PCR反应具有无与伦比的优越性。但由于沙门氏菌血清型特别繁多（目前世界上已分离出近2 000多个血清型，我国也已发现了近百个血清型），因此，对沙门氏菌的检测往往不能准确和灵敏。 五、检测方法分析 常规法是目前国内绝大多数检测机构都在使用的方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，人们已创建了不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的沙门氏菌检测方法。而且以金标试纸为代表的这些方法已经被先进国家所广泛使用，引进和消化这些先进的方法是我们检测领域的当务之急。