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大肠杆菌O157：H7 黄曲霉毒素 李斯特菌 沙门氏菌 盐酸克伦特罗（clenbuterol） 氯霉素残留及检测 磺胺类药物 |
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单核细胞增生李斯特菌 一、概况： 李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。目前国际上公认的李斯特菌共有七个菌株： 1、 单核细胞增生李斯特菌 (L.monocytohenes) 2、 绵羊李斯特菌 (L.iuanuii) 3、 英诺克李斯特菌 (L.innocua) 4、 威尔斯李斯特菌 (L.innocua) 5、 西尔李斯特菌 (L.seeligeri) 6、 格氏李斯特菌 (L.grayi) 7、 默氏李斯特菌 (L.murrayi) 其中单增李斯特菌是唯一能引起人类疾病的。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。 (一) 特点： 1、 分布广：存在于土壤、水域(地表水、污水、废水)、昆虫、植物、蔬菜、鱼、鸟、野生动物、家禽。 2、 生存环境可塑性大：能在2-42℃下生存(也有报道0℃能缓慢生长 )能在冰箱冷藏室内较长时间生长繁殖。 3、 适应范围大：酸性、碱性条件下都适应。 4、带菌较高的食品有：牛奶和乳制品；肉类(特别是牛肉)；蔬菜；沙拉；海产品；冰淇凌等。 （二）流行情况： 1999年底，美国发生了历史上因食用带有李斯特菌的食品而引发的最严重的食物中毒事件，据美国疾病控制和防治中心资料显示，在美国密歇根州有14人因食用被该菌污染的 “热狗”和熟肉而死亡，在另外22个州97人患此病，6名妇女流产。 1992-1995年法国出产的奶酪及猪肉中发现李斯特菌，2001年11月以来，我国质检部门多次从美国、加拿大、法国、爱尔兰、比利时、丹麦等二十多家肉类加工厂进口的猪腰、猪肚、猪耳、小排等三十多批近千吨猪副产品中检出单增李斯特菌、沙门氏菌等致病菌。 二、流行病学 单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6-16%,有70%的人可短期带菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。 该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿,栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途径，且有上升趋势。 三、致病性： 单增李斯特菌进入人体是否得病与菌量和宿主的年龄免疫状态有关，因为该菌是一种细胞内寄生菌，宿主对它的清除主要靠细胞免疫功能，因此，易感者为新生儿、孕妇、40岁以上的成人，免疫功能缺陷者。 潜伏期：在感染后3-70天出现症状，健康成人可出现轻微类似流感症状，易感者突然发热，剧烈头痛、恶心、呕吐、腹泻、败血症、脑膜炎、孕妇出现流产。 单增李氏菌的抗原结构与毒力无关，它的致病性与毒力机理如下： 1、寄生物介导的细胞内增生，使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞； 2、抗活化的巨噬细胞，单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内的过氧物（为杀菌的毒性游离基团）分解； 3、溶血素，即李斯特杆菌溶血素O，可以从培养物上清液中获得，为SH活化的细胞溶素，有α和β两种，为毒力因子。 临床表现：健康成人个体出现轻微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然流产、脑膜炎、败血症直至死亡。 控制：单增李斯特氏菌在一般热加工处理中能存活，热处理已杀灭了竞争性细菌群，使单增李斯特氏菌在没有竞争的环境条件下易于存活，所以在食品加工中，中心温度必须达到70℃持续2分钟以上。单增李斯特氏菌在自然界中广泛存在，所以即使产品已经过热加工处理充分灭活了单增李斯特氏菌，但有可能造成产品的二次污染，因此蒸煮后防止二次污染是极为重要的。由于单增李斯特氏菌在4℃下仍然能生长繁殖，所以未加热的冰箱食品增加了食物中毒的危险。冰箱食品需加热后再食用。 农产品安全质量无公害水产品安全要求GB18406.4-2001 2001年10月1日实施， 对鱼肉、贝类、甲壳类(虾蟹)爬行类(鱼)两栖类、蛙等，制定了微生物指标： 细菌总数 个/g ≤106 大肠菌群 个/g ≤10 致病菌 沙门氏菌、李斯特菌、副溶血性弧菌 不得检出 四、检验方法： （一） 国标法 (常规法) 1、增菌培养 取回的样品应在4℃下处理、存放和运送，如果是冷冻样品，则在检验前要保持冷冻状态。 取25mL液体或25g半固体或固体样品放入含有225mL无选择性试剂增菌肉汤（EB）的均质杯中进行均质，然后转入三角瓶中，30℃培养4h，加入选择性试剂吖啶黄素、萘啶酮酸和放线菌酮，继续培养20h和44h.。 2、分离 共培养24h和48h后，取EB培养物分别在OXA和LPM或加七叶苷/Fe3+LPM琼脂平板上划线。PALCAM琼脂可替代LPM琼脂。将OXA和PALCAM平板置于35℃培养24-48h，LPM平板在30℃培养24-48h。然后，把LPM平板放于解剖镜载物台上，以450角入射光从平板下面照射平板，通过目镜垂直向下观察寻找可疑菌落。李斯特氏菌在LPM平板上呈有光泽的兰色或灰色。用已知阳性菌和阴性菌划线的平板作对照。 加入七叶苷和Fe3+的LPM平板不用斜射光系统，选择可疑菌落的方法与在OXA上选择可疑菌落的方法相同。在OXA平板上李斯特氏菌菌落周围有一个黑色环，其它菌也可形成黑色环，但形成时间要在两天以上。李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上的菌落特征相似。 在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5个或更多的典型菌落，分别划线于TSAYE平板上以得到更纯、更典型的单个菌落。食品检验中在TSAYE平板上纯化是必须的，因为在PALCAM和OXA或LPM平板上分离菌落时可能沾有不可见的受抑微生物。挑取5个典型菌落的原因是一个样品中可能分离到一种以上的李斯特氏菌。30℃TSAYE平板培养24-48h，如果不用于动力观察，也可在35℃培养。 3、鉴定步骤 （1）观察TSAYE平板通过斜射光观察，寻找呈兰灰至兰色菌落。在TSAYE上用已知菌作对照。 （2）、从30℃或更低温度下培养的TSAYE平板上挑取典型菌落做成湿玻片在油镜下观察。湿玻片用0.85%生理盐水菌悬液制成。如果菌量太少，菌体黏附于载玻片上而呈现非运动性。李斯特氏菌是细短杆菌，可见轻微的旋转及翻滚。与已知的李斯特氏菌的对照相比，球形、大的杆状且快速泳动的都不是李斯特氏菌。 （3）挑取典型菌落进行过氧化氢酶实验，李斯特氏菌呈过氧化氢酶阳性反应。 （4）取16-24h的培养物进行革兰氏染色，李斯特氏菌呈革兰氏阳性杆菌。但是陈旧培养物革兰氏染色会发生变化，而且菌体可成球形。在染色过重的玻片上菌体有呈栅状排列的趋势，易误认为白喉菌而错判。 （5）挑取典型菌落接种于TSBYE肉汤管中，35℃培养24h用做糖类发酵和其它生化项目实验。TSBYE肉汤管在4℃下可存放几天，也可反复接种。 （6）在TSAYE平板上挑取典型菌落刺种到5%的绵羊血或马血琼脂平板上，刺种时避免触到平板底部和使琼脂破裂，同时设阳性对照（单核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性对照（英诺克李斯特氏菌），35℃培养48h。单核细胞增生李斯特氏菌呈窄小的β-溶血环。 （7）在明亮的光照下，观察经穿刺的血琼脂平板，单核细胞增生李斯特氏菌和西尔李斯特氏菌围绕穿刺点产生较清晰的β-溶血环，英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象，而绵羊李斯特氏菌产生界限明显的较大溶血环，在此不要试图进行种间的区分，但要记录下溶血反应的特征，CAMP试验可区分它们间的溶血反应。 （8）硝酸盐还原试验（选做）。用TSBYE肉汤培养物接种于硝酸盐肉汤中，35℃培养5天后，加入0.2mL试剂A，再加入0.2mL试剂B，混合，出现紫红色为阳性反应，表明硝酸盐已被还原，如无颜色出现，在试管内再加入少量锌粉，放置1h，如出现紫红色，表明硝酸盐仍存在，未被细菌还原。只有默氏李斯特氏菌还原硝酸盐，因此，从格氏李斯特氏菌中区分出默氏李斯特氏菌就必须进行这唯一的试验。本试验还有一等效试验，即加入0.2mL试剂A后，再加入0.2mL试剂C，出现橙色表明硝酸盐已被还原。如未出现颜色反应，也加入少量锌粉，若出现橙色表明硝酸盐未被还原。 （9）将TSBYE培养物穿刺到SIM和MTM试管中，室温培养7天，每日观察，李斯特氏菌呈典型伞状生长。在MTM中伞状生长更典型。同时，30℃的TSBYE培养物在油镜下可见细菌作翻转运动。 （10）将TSAYE肉汤培养物分别接种于0.5%（W/V）葡萄糖、麦芽糖、七叶苷、甘露醇、鼠李糖、木糖发酵管内（可选用倒立发酵管），35℃培养7天，呈阳性反应的李斯特氏菌产酸不产气，李斯特氏菌发酵鼠李糖和木糖的情况见下表。所有李斯特氏菌对葡萄糖、七叶苷、麦芽糖均能发酵，除格氏李斯特氏菌均不能发酵甘露醇。如果在OXA、PALCAM或加七叶苷/Fe3+的LPM分离平板上菌落色素很明显，则七叶苷试验可免做。 4、李斯特氏菌属的区别 将TSBYE肉汤培养物接种到3mLTSBYE肉汤中，35℃培养24h，接种2支TSAYE琼脂斜面，35℃培养24h。用3mL0.01mol/l磷酸盐缓冲液将斜面菌苔洗下，菌悬液于80℃水浴中加热1h，以2500r/min离心30，弃去2mL上清夜，将剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清学玻片凝集试验。 5、小鼠毒力试验 将分离的菌株接种到10 mL TSBYE肉汤中，35℃培养24h，将培养物离心、浓缩，用1mL生理盐水制成菌悬液（浓度为1010个菌/mL），取0.1mL腹腔注射体重为16-18g 小鼠，每组5个观察7d内小鼠死亡情况。用已知致病的单增李斯特氏菌和非致病的英诺克李斯特氏菌相同方法进行，做对照试验。 6、协同溶血（CAMP）试验 在羊血琼脂平板上平行接种β-溶血金黄色葡萄球菌（S.aureus）和马红球菌(R.equi),在它们中间垂直划线接种可疑菌，与两线相近但不相交，在30℃培养24h-48h,检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单增李斯特氏菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强，绵羊李斯特氏菌在马红血球附近的溶血增强。 (二) 免疫学检测方法 1、聚合酶免疫检测方法(EIA) 20世纪80年代初已有许多商品化产品供应于市场 原理 Assurance?多克隆酶联免疫分析(EIA)，将对单增李斯特菌和其他李斯特菌抗原有高度特异性的抗体固定在微孔内壁上。经增菌培养后的样品和阳性对照加到检测板的微孔内。如有李斯特氏菌抗原存在，则在微孔内形成抗体-抗原混合物。没有反应的样品物质被冲掉。加入抗李斯特菌特异抗体，重复孵育、冲洗程序，然后加入碱性磷酸酶接合剂，使酶与李斯特菌抗原相结合，孵育后，没有结合的接合物质被冲洗掉，加入底物显色，用405-410nm的光学测量仪读数，计算临界值。可疑阳性结果须经培养方法证实。 2、 自动酶联荧光免疫检测系统（VIDAS）分析方法 自动酶联荧光免疫检测系统（VIDAS）分析方法是对李斯特菌属全部种的筛检，VIDAS LMO则是对李斯特菌属中主要致病菌－单增李斯特菌的筛检。 原理 李斯特菌的抗原鉴别是基于在VIDAS仪器内进行的酶联荧光免疫分析。像吸液管的装置是固相容器（SPR），在分析中既作为固相也作为吸液器。SPR包被有高特异的李斯特菌抗体。分析用试剂均密封于试剂条内，分析的每一步都是自动执行的。煮沸一定量的增菌肉汤加入试剂条，肉汤中的混合物在特定时间内循环于SPR内外。如果有李斯特菌抗原存在则与包被在SPR内的单克隆抗体结合，其他没有结合上的化合物被冲洗掉。结合有碱性磷酸酶的抗体在SPR内外循环与结合在SPR内壁上的李斯特菌抗原结合，最后的冲洗步骤将没有结合的接合剂冲洗掉。底物—4-甲基伞形磷酸酮被SPR壁上的酶转换成荧光产物—4-甲基伞形酮。荧光强度由光学扫描器测定。实验结果由计算机自动分析，产生基于荧光测试的试验值与标准相比较后打印出每一个被测样品的阳性或阴性结果报告。 3 金标试纸法 该方法可应用于乳制品、红肉、禽类产品、水果、坚果、海产品、意大利面制品、蔬菜、奶酪、动物肉类、巧克力和蛋品中的李斯特菌的检测。 原理 特异性的抗－单增李斯特菌及其相关李斯特菌抗原的抗体被缚在色原载体上，并且可与固相支撑基质分离。当有李斯特氏菌存在时，测试单元的试剂被展开，并产生可视的确定反应。李斯特菌抗原与抗体－色原复合物反应，形成抗原-抗体-色原复合物。此复合物穿过侧面流动膜流动，随后与固定在膜上的抗体结合。阳性反应在测试窗有一指示阳性的模线。有效的测试应在确认窗有另一条模线存在，如无线为无效测试。 美国REVEAL李斯特菌快速检测试纸是对李斯特菌属中的特征鞭毛抗原的检测。李斯特菌属的阳性结果并不一定说明单增李斯特菌的存在，它只是说明环境的卫生状况需要改善或操作过程需要进一步控制，以减少环境中存在单增李斯特菌的可能。 产品快速方便，适用于各种食品及环境样品。43小时可以得到结果，其中包括两次增本菌培养和20分钟的试纸检测。 将样品经过两次增菌后，取135ul的增菌培养液放入试纸夹的样品槽中，增菌液滴入20分钟后，观察试纸C区和T区有无明显的线。在C和T区都有可见的线，则结果为阳性。C区有线、T区无线，则结果为阴性。如C区无线，无论T区有没有线，则实验无效。如李斯特有菌存在，试纸T区有一个明显的线，无论它的强弱，样品都应被认为是阳性的。 4、DNA探针技术 原理 用特异性的DNA探针进行单增李斯特菌核糖体RNA（rRNA）的检测。待检样品经前增菌和二次增菌后溶解细菌。加入标记好的单增李斯特菌特异性的DNA探针用于液相杂交。如果待检样品中存有单增李斯特菌rRNA，荧光素标记的检测探针和多聚脱氧腺嘌呤核苷酸(polydeoxyadenylic acid,poly dA)末端捕获探针将与目标rRNA序列进行杂交。然后把包被有多聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸(polydeoxythmidylic acid,poly dT)的塑料测杆(固相)插入杂交溶液。Poly dA和pol dT之间进行碱基配对，便于探针捕获：目标杂种核酸分子结合在固体载体上，未结合的探针被冲洗掉。测杆被培养在辣根过氧化物酶-抗荧光素接合剂中。接合剂与存在于杂交检测探针上的荧光素标记物结合，未结合的剂被冲洗掉。并将测杆培养于酶底物-色原溶液中，辣根过氧化物酶与酶底物反应，将色原转变为蓝色化合物。一旦遇酸反应便停止，色原的颜色变为黄色。在450nm处测量吸收值，吸收值大于临界则表明在待检的样品中存有单增李斯特菌。 五、检测方法分析 常规法是目前国内绝大多数检测机构都在使用的方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，人们已创建了不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的李斯特菌检测方法。而且以金标试纸为代表的这些方法已经被先进国家所广泛使用，引进和消化这些先进的方法是我们检测领域的当务之急。 |
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