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大肠杆菌O157：H7 黄曲霉毒素 李斯特菌 沙门氏菌 盐酸克伦特罗（clenbuterol） 氯霉素残留及检测 磺胺类药物 |
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黄曲霉毒素 一、 概述 1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时，可导致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。 1、发现：上世纪60年代，在英国发生的十万只火鸡突发性死亡事件被确认与从巴西进口的花生粕有关。进一步的调研证明，这些花生粕被一种来自真菌的有毒物质污染，这些研究工作最终使人们发现了黄曲霉（Aspergillus.flavus）产生的有毒代谢物质，黄曲霉毒素（Aflatoxins）。是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，特曲霉也能产生黄曲霉毒素，但产量较少。产生的黄曲霉毒素主要有B1、B2 、G1 、G2 以及另外两种代谢产物M1 、M2。其中M1 和M2是从牛奶中分离出来的。B1、B2 、G1 、G2 、M1 和M2的在分子结构上十分接近。 2、化学结构：黄曲霉毒素（Aflatoxins），是一组化学结构类似的化合物，目前已分离鉴定出12种，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。黄曲霉毒素的的基本结构为二呋喃环和香豆素，B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物。即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）。前者为基本毒性结构，后者与致癌有关。M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物。黄曲霉毒素的主要分子型式含 B1、B2、G1、G2 ，M1、M2等。其中M1和M2 主要存在于牛奶中。B1为毒性及致癌性最强的物质。 《黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2化学结构式》
3、理化特性：在紫外线下，黄曲霉毒素B1、B2发蓝色荧光，黄曲霉毒素G1、G2发绿色荧光。黄曲霉毒素的相对分子量为312-346。难溶于，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解，在pH9-10的强酸溶液中分解迅速。其纯品为无色结晶，耐高温，黄曲霉毒素B1的分解温度为268℃紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。 二、 分布 黄曲霉毒素存在于土壤、动植物、各种坚果、特别是花生和核桃中。在大豆、稻谷、玉米、通心粉、调味品、牛奶、奶制品、食用油等制品中也经常发现黄曲霉毒素。一般在热带和亚热带地区，食品中黄曲霉毒素的检出率比较高，在我国，产生黄曲霉毒素的产毒菌种主要为黄曲霉，1980年测定了从17个省粮食中分离的黄曲霉1660株，广西地区的产毒黄曲霉最多，检出率为58%。总的分布情况为：华中、华南、华北产毒株多，产毒量也大，东北、西北地区较少。 三、 黄曲霉毒素中毒及其对人畜的危害 黄曲霉毒素对人和动物健康的危害均与黄曲霉毒素抑制蛋白质的合成有关。黄曲霉毒素分子中的双呋喃环结构，是产生毒性的重要结构。研究表明，黄曲霉毒素的细胞毒作用，是干扰信息RNA和DNA的合成，进而干扰细胞蛋白质的合成，导致动物全身性损害（Nibbelink,1988）。黄光琪等（1993）研究指出，黄曲霉毒素B1能与tRNA结合形成加成物，黄曲霉毒素-tRNA加成物能抑制tRNA与某些氨基酸结合的活性，对蛋白质生物合成中的必需氨基酸，如赖氨酸、亮氨酸、精氨酸和甘氨酸与tRNA的结合，均有不同的抑制作用，从而在翻译水平上干扰了蛋白质生物合成，影响细胞代谢。。 1、黄曲霉毒素与动物疾病 黄曲霉毒素中毒（Aflatoxicosis）主要对动物肝脏的伤害，受伤害的个体因动物种类、年龄、性别和营养状态而异。研究结果表明，黄曲霉毒素可导致肝功能下降，降低牛奶产量和产蛋率。并使动物的免疫力降低，易受有害微生物的感染。此外，长期食用含低浓度黄曲霉毒素的饲料也可导致胚胎内中毒。通常年幼的动物对黄曲霉毒素更敏感。黄曲霉毒素的临床表现为消化系统功能紊乱，降低生育能力。降低饲料利用率、贫血等。黄曲霉毒素不仅能够使奶牛的产奶量下降，而且还使牛奶中含有转型的黄曲霉毒素M1和M2。据美国农业经济学家统计，由于食用黄曲霉毒素污染的饲料，每年至少要使美国畜牧业遭受10%的经济损失。在我国，由此而带来的畜牧业损失可能会更大。 2、黄曲霉毒素与人类的健康 人类健康受黄曲霉毒素的危害主要是由于人们食用被黄曲霉毒素污染的食物。对于这一污染的预防是非常困难的，其原因是由于真菌在食物或食品原料中的存在是很普遍的。国家卫生部门禁止企业使用被严重污染的粮食进行食品加工生产，并制定相关的标准监督企业执行。但对于含黄曲霉毒素浓度较低的粮食和食品无法进行控制。在发展中国家，食用被黄曲霉毒素污染的食物与癌症的发病率呈正相关性。亚洲和非洲的疾病研究机构的研究工作表明，食物中黄曲霉毒素与肝细胞癌变 (Liver Cell Cancer，LCC) 呈正相关性。长时间食用含低浓度黄曲霉毒素的食物被认为是导致肝癌、胃癌、肠癌等疾病的主要原因。1988年国际肿瘤研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC) 将黄曲霉毒素B1列为人类致癌物。除此以外，黄曲霉毒素与其它致病因素（如肝炎病毒）等对人类疾病的诱发具有叠加效应。 黄曲霉毒素Bl的半数致死量为0．36毫克／公斤体重，属特剧毒的毒物范围（动物半数致死量＜10毫克／公斤＝它的毒性比氰化钾大10倍，比砒霜大68倍）。它引起人的中毒主要是损害肝脏，发生肝炎,肝硬化, 肝坏死等。临床表现有胃部不适、食欲减退、恶心、呕吐,腹胀及肝区触痛等；严重者出现水肿、昏迷，以至抽搐而死。黄曲霉毒素是目前发现的最强的致癌物质。其致癌力是奶油黄的900倍，比二甲基亚硝胺诱发肝癌的能力大75倍，比3，4苯并芘大4000倍。它主要诱使动物发生肝癌，也能诱发胃癌、肾癌、直肠癌及乳腺、卵巢、小肠等部位的癌症。 四、检验检疫： (一)部分国家检验检疫要求： ● 1995年，世界卫生组织制定的食品黄曲霉毒素最高允许浓度为15ug/kg。 ● 我国政府对各种食物中黄曲霉毒素的最高允许量见表2。 表2 中国对食品中黄曲霉毒素的最高允许含量
● 美国联邦政府有关法律规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒含量(指B1+B2+G1+G2的总量)不能超过15ug/kg。人类消费的牛奶中的含量不能超过0.5ug/kg,其他动物饲料中的含量不能300ug/kg。 ● 而欧盟国家规定更加严格，要求人类生活消费品中的黄曲霉毒素B1的含量不能超过0.05ug/kg。 (二)检验检疫方法： 1、薄层层析法 薄层层析(Thin-Layer Chromatography，TLC)是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术。自1990年，它被列为AOAC (Association of Official Agricultural Chemists)标准方法，该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能。 2、液相色谱法 液相色谱(Liquid Chromatography，LC)与薄层层析在许多方面具有相似性，二者互相补充。通常用TLC进行前期的条件设定，选择适宜的分离条件后，再用LC进行黄曲霉毒素的定量测定。 3、免疫化学分析方法 利用具有高度专一性的单克隆抗体或多克隆抗体设计的黄曲霉毒素的免疫分析方法，也是最常用的黄曲霉毒素检测方法。这类方法通常包括放射免疫分析方法(Radioimmunoassay，RIA)，酶联免疫法(Enzyme-linked of Immunosorbent Assay，ELISA)和免疫层析法(Immunoaflinity Column Assay，ICA)。它们均可以对黄曲霉毒素进行定量测定。 (1) 免疫亲和柱-荧光分光光度法和免疫亲和术-HPLC法 免疫亲和柱法和酶联免疫吸附法虽然都可达到速简便效果，但酶联免疫吸附法仅能检测单一毒素(如黄曲霉毒素B1)含量，而且易出现假阳性结果，难以控制。免疫亲和柱法(包括荧光光度法和HPLC法)却能达到既定量准确又快速简便的要求。 免疫亲和柱的使用可以避免传统TLC和HPLC的缺点，同时免疫亲和柱与TLC和HPLC法结合可以大大提高工作效率，提高灵敏度和准确度。 黄曲霉毒素免疫亲和柱-荧光光度计法是以单克隆免疫亲和柱为分离手段，用荧光计、紫外灯作为检测工具的快速分析方法。它克服了TLC和HPLC法在操作过程中使用剧毒的真菌毒素作为标定标准物和在样品预处理过程中使用多种有毒、异味的有机溶剂，毒害操作人员和污染环境的缺点。同时黄曲霉毒素免疫亲和柱-荧光光度计法分析速度快，一个样品只需10-15min,比传统方法快几个小时甚至几天时间；仪器设备轻便容易携带，自动化程度高 ，操作简单，直接读出测试结果，可以在小型实验或现场使用。可以进行黄曲霉毒素总量 (B1B2G1G2) 的测定，检测限可达到1ug/kg，达到黄曲霉毒素标准限量值以下测定范围为1-300ug/kg。 黄曲霉毒素免疫亲和柱-高效液相色谱法比传统的HPLC法更加安全、可靠、灵敏度和准确度高。它采用单克隆抗体免疫技术，可以特效性地将黄曲霉毒素或其他真菌毒素分离出来，分离效率和回收率高。 分析原理试样中的黄曲霉毒素用一定比例的甲醇/水提取液经过过滤，稀释后，用免疫亲和柱净化，以甲醇将亲和柱上的黄曲霉毒素淋洗下来，在淋洗液中加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度，然后用荧光分光光度计进行定量。也可以将甲醇-黄曲霉毒素淋洗液的一部分注入HPLC中，对黄曲霉毒素B1、B2、G1、B2分别进行定量分析。免疫亲和柱是用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体固化在水不溶性的载体上，然后装柱而成。该方法的测定范围0-300ug/kg。 (2) 酶联免疫吸附法： 1996年，Nakane 建立了辣根过氧化物酶标记抗体的测定技术。由于该方法简便、敏感、特异，可作为多种抗原或抗体的测定，20世纪70年代后期，该方法引入真菌毒素的检测中，下面介绍的是竞争性酶联免疫吸附间接法检测黄曲霉毒素B1。 原理：将已知抗原吸附在固态载体表面，洗除末吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品(含有抗原)提取液的混合液，竞争培养后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原抗体结合物相结合，再加入酶底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色物质，通过酶标检测仪测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。 (3) 微柱筛选法 可以用来半定量测定各种食品中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的总量。 原理 样品提取液中的黄曲霉毒素被微柱管风硅镁型吸附层吸附后，在波长365nm紫外光灯下显示蓝紫色荧光环，其荧光强度与黄曲霉毒素在一定的光密度范围内成正比例关系。若硅镁型吸附剂层未出现蓝紫色荧光，则样品为阴性(方法灵敏度为5-10ug/kg)。由于在微柱上不能分离黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2，所以测得结果为总的黄曲霉毒素含量。 (4) 一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法 一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法。由此产生的一步式黄曲霉毒素快速检测试纸可在5—10分钟完成对样品中黄曲霉毒素的定性测定。借助黄曲霉毒素标准样品，这种方法能估算黄曲霉毒素的含量，非常适用于现场测试和进行大量样品的初选。 五、检测方法分析 薄膜层析法和液相色谱法是目前国内绝大多数检测机构都在使用的方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，人们已创建了不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的黄曲霉毒素检测方法。而且以金标试纸为代表的这些方法已经被先进国家所广泛使用，引进和消化这些先进的方法是我们检测领域的当务之急。免疫亲和柱法优点很多，但由于检测费用过高，而无法普及。而一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法似乎更适用于我国，值得推广。 |
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