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| ELISA试剂盒检测过程中的注意事项 黄曲霉毒素的提取方法 0.5%卵清蛋白缓冲液的制备 PBS（pH 7.4）溶液的制备 |
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| ELISA试剂盒检测过程中的注意事项 ELISA的实验操作所要求的条件是比较严格的，无论是对实验的硬件条件还是对实验的操作人员的技术要求，都是如此。下面所提到的就是一些在进行ELISA实验时所要注意的一些问题。 一、ELISA实验通用规则 1、要保证移液枪的准确性，误差不能超过2%。可用水和电子天平进行确定。但最好有专业人员进行矫正。 2、要配备20ul、50ul、100ul、1000ul和排枪各一支。吸取不同的液体后，要更换枪头。即使是吸取标准品时。 3、要在实验前1小时将试剂盒从冰箱中取出，使各种试剂都恢复到室温，以使结果更稳定。 4、实验时，要使底物避光保存。 5、用枪吸取液体时速度不能太快，以免产生气泡而使吸取量不准确。 6、吸取液体时，要用量程和需要量接近的枪去吸，减少误差。 7、将液体加到酶标孔中时，避免枪头和孔内液体接触，可使枪头上的液滴和孔壁接触，液滴会自然流下去。 8、液体全部加完后，可将酶标板在桌子上平行轻轻晃动30秒，混匀液体。也可以用酶标仪的晃动功能。 9、温浴时，要用不干胶或胶带纸封好酶标板，防止水分的蒸发。 10、洗板时，每次洗液加入后，应静置1分钟，使清洗更加彻底。没有洗板机时，倒去液体后，要将酶标板在报纸或毛纸上用力拍干。 11、洗液不够时，可用蒸馏水自行配制PH7.4，0.02M的磷酸缓冲液，加入0.1%的吐温20作为洗液。加入1/1000的叠氮钠后可长期保存。 12、底物是光敏感的，要在临用前现配。 13、检测前，要打开酶标仪，使之稳定10分钟以上。 14、底物有一定的毒性，终止液对皮肤有腐蚀性，应尽量避免接触。 15、待检样品要澄清，否则会影响结果。 16、温浴时间应遵守试剂盒规定。 17、应尽量做双孔实验，这样才能保证数据的准确性。 18、对结果有疑问的样品要用其它方法进行确证。 二、下面所提到的是针对我公司的ELISA产品会出现的问题及解决办法 1. 加入反应终止液后，没有吸光值或吸光值偏低。 a.原因：未加入酶标记物。 解决办法：请按照操作步骤进行。 b.原因：试剂盒内容物未能充分回。 解决办法：确定试剂盒内容物回温后再进行操作。 c.原因：室温太低。 解决办法：若室温太低(<19℃)，请于操作步骤4，适当延长温育时间。 d.原因：未使用试剂盒的清洗液清洗。 解决办法： 请用试剂盒内所提供的清洗液清洗。 e.原因：试剂盒已过有效期限。 解决办法：请更换成仍在有效期限内的试剂盒。 2. 标准曲线线性不佳，或是平行性不好。 a.原因：温育位置避光不好或受到气流干扰。 解决办法： 请确认温育位置既不透光也不透风(如抽屉内)。 b.原因：操作时间拖太久。 解决办法：请在方法熟练后再进行操作。 c.原因：微孔间相互污染。 解决办法： 加样品时，请小心勿溅出微孔外，以免造成其它微孔的污染。 d.原因：标准品或酶标记物所加入的量不一致。 解决办法：请使用已校正过的移液枪，并确保其与吸头之间有高度密合性。 e.原因：添加样品或试剂的操作方法不正确。 解决办法：加样品或试剂时，吸头请勿接触微孔。 f.原因：洗板过程发生问题(如管路堵塞、洗完板后未立刻进行下一步骤)。 解决办法：请随时监控洗板机洗板过程，洗完后立即进行下一步骤。 3. 吸光值均偏高(或线性不够陡)。 a.原因：室温太高(>25℃)。 解决办法： 若无法降低室内温度，请适当缩短步骤4的温育时间。 b.原因：底物溶液受到污染。 解决办法： 若发现底物溶液已呈现淡蓝色，请不要再使用。 c.原因：反应时间超过太久。 解决办法：请控制反应时间。 d.原因：酶标记物污染了盒内其它试剂。 解决办法：使用过的吸头应立即丢弃，可避免试剂间相互污染，凡是试剂(特别是酶标记物与底物溶液)接触过的容器应立即清洗干净。(先以漂白水浸泡，再以清水冲洗干净，可确保无残留) 4. 阴性标准品的吸光值低于阳性标准品的吸光值。 a.原因：微孔中的试剂未能充分混合。 解决办法： 试剂加完后，需轻敲盘四周使其充分混合均匀。 b.原因：洗板过程发生问题(同2-f.)。 解决办法：请参考2-f. c.原因：添加样品或酶标记物的量不一致。 解决办法： 请参考2-d. |
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黄曲霉毒素的提取方法 一、固体及固体粉末的提取法 1、称取20.00克粉碎过筛样品，加入130毫升提取液（含30毫升正己烷、55毫升甲醇、45毫升水）； 2、振摇30分钟，静置片刻，用快速定性滤纸过滤，滤液加入到分液漏斗中，静置分层； 3、20毫升下层甲醇溶液，用20毫升三氯甲烷萃取，振摇2分钟，静置分层； 4、取下层三氯甲烷，经用三氯甲烷润湿过的10克无水硫酸钠和定量慢速滤纸过滤，滤液进入蒸发皿； 5、再用5毫升三氯甲烷重复萃取，过滤，用少量三氯甲烷洗过滤器，滤液、洗液并入蒸发皿； 6、将蒸发皿通风挥干，冷却2-3分钟后，准确加入1毫升苯-乙腈（体积比为98：2）混合液； 7、若有苯的晶体析出，停止冷却，继续溶解混和，待晶体消失，取上清即为样品提取液。 此苯-乙腈为基质的提取液，可作为黄曲霉毒素的检测。 二、油类提取法： 1、称取4.00克样品，加入20毫升正己烷（或石油醚）移入分液漏斗中，用20毫升甲醇水溶液分次洗容器，洗液并入分液漏斗中； 2、振摇2分钟，静止分层，将下层甲醇水溶液用20毫升三氯甲烷萃取，振摇2分钟，静止分层。以下操作同方法一中的4-7。 干酱类（包括豆豉、腐乳制品）提取法： 1、称取20.00克研磨均匀的样品，加入20毫升正己烷（或石油醚）和50毫升甲醇溶液，振摇30分钟，静止片刻，用快速定性滤纸过滤，滤液静止分层； 2、取24毫升下层甲醇水层，用20毫升三氯甲烷萃取，振摇2分钟，静止分层。以下操作同方法一中的4-7。 三、酱油、醋提取法： 称取10.00克样品，0.4克氯化钠，用15毫升三氯甲烷萃取，振摇2分钟，静止分层。以下操作同方法一中的4-7。 |
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| 0.5%卵清蛋白缓冲液的制备 1. 称取0.25g卵清蛋白于试剂瓶中。 2. 称量50ml的PBS缓冲液将卵清蛋白溶解。 3. 加搅拌子进行电搅拌10分钟，溶解完全。备用。 |
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PBS（pH 7.4）溶液的制备 1. 称取0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4、8.0g NaCl、0.2g KCl。 2. 量取1000ml蒸馏水于试剂瓶中，溶解上述试剂。 3. 调pH至7.4，用于溶解卵清蛋白。 |
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